免疫组化（IHC）是一种重要的评估东西，属于免疫染色手艺的范围，操纵抗原-抗体连系来研究感兴趣的组织中目的分子的形态。IHC与显微镜和图像阐发手艺相连系，已经成为一个十分强大的东西，操纵匹敌原特异性的标识表记标帜抗体，供给组织抗原的间接可视化。因为那种手艺的多功用性、简单性和廉价性，IHC如今是组织学、病理学、癌症生物学、神经科学和药物发现范畴不成或缺的。
抗体是小的卵白量分子，由身体的免疫系统天然表达，以应对外来分子（抗原）的进入并帮忙中和它。因而，抗体是对潜在有害的外来生物体及其产品的一种防御。抗原-抗体反响的美好之处在于，每个抗体只匹敌原的一部门有特异性，称为表位，不与其他不契合其目的的分子连系，包罗人体本身分子。所有的免疫染色手艺，包罗IHC，都操纵了抗原-抗体反响特异性的那一重要特征，以确保从成千上万的差别分子中检测出单一的分子类型（图1）。
图1 | 抗原-抗体反响的特异性示企图，它能在成千上万的细胞内分子情况中检测和定位一个目的。图中显示对卵白5的特异性抗体只与卵白5连系。若是没有Emil von Behring和Shibasabura Kitasato在1890年发现的抗体，那一重要手艺的开展是不成能的[1]，但曲到1923年，Michael Heidelberger才用标识表记标帜的抗原检测到抗原-抗体复合物[2]。尔后，John Richardson Marrack的工做描述了抗原-抗体反响的性量。Marrack在1934年是第一个将染料附着在抗体上的人[3,4]。1941年，Albert Hewett Coons等人创始了用荧光标签、荧光素标识表记标帜抗体并检测细胞和组织中各自的抗原[5]，并启动了免疫染色革命[6]。尔后，该手艺得到了很大的开展和改良，已经成为发现和诊断的重要东西。
什么是免疫组织化学（IHC）？IHC接纳了组织学、剖解学、免疫学和生物化学的连系来检测组织内特定目的的数量、散布和定位。针对感兴趣的分子（凡是是一种卵白量）的抗体是在差别物种的生物体中产生的，凡是被标识表记标帜或由另一组标识表记标帜的抗体辅助。组织样本根据专门的手艺筹办，以使抗体进入，并利用光镜或电子显微镜检测标签（图2）。
图2 | 色氨酸羟化酶2的免疫组化染色，显示了人类背侧剑突的5-羟色胺能神经元及其突起。免疫染色与免疫组化染色（IHC染色）的区别是什么？免疫染色是一个总的术语，包罗所有接纳抗原-抗体反响检测分子的手艺。免疫组化或免疫组化染色是免疫染色的一个详细应用案例，当抗原-抗体反响被用来研究组织（来自希腊语histos，意思是组织）平分子的形态时。
免疫组化与免疫荧光之间有什么区别？免疫组化和免疫荧光那两个术语是按照免疫染色手艺中利用的样品类型和检测办法来应用的。免疫组化是指评估组织中的目的抗原，其检测办法能够是色原性或荧光性的。另一方面，免疫荧光既可指对细胞和组织中的目的抗原停止评估，又出格涉及荧光标签（荧光基团）的检测（图3）。
图3 | 酪氨酸羟化酶的免疫荧鲜明示了小鼠中脑的多巴胺能神经元。免疫细胞化学与免疫组织化学的区别是什么？免疫组化涉及研究组织样本中抗原的形态，而免疫细胞化学指的是当感兴趣的样本是培育中的细胞（来自希腊语cyto，意思是细胞）时的免疫染色。
免疫组织化学是若何工做的？免疫组化的胜利取决于多个参数。因而，科学的办法和精心的尝试设想是获得可靠和可反复数据的关键。
简要介绍一下所涉及的步调[7]，IHC是在从被研究的生物体中获得的薄薄的组织切片长进行的。然后对那些组织切片停止处置，使其可以进入与感兴趣的抗原特异性连系的抗体。凡是情况下，二级抗体将被应用，与一级抗体特异性连系并停止检测。在发色剂检测办法中，二级抗体被标识表记标帜为一种催化发色剂反响的酶。在免疫荧光检测办法中，二级抗体被标识表记标帜了一个荧光团，能够在荧鲜明微镜下间接察看。
如今让我们考虑一下停止IHC时需要考虑的差别参数。
组织：组织的来源，即研究的生物体的品种和感兴趣的器官，将决定若何收罗和筹办切片的组织。在停止尝试之前，必需参考与特定生物体有关的文献，以领会收成组织的手艺和停止IHC时必需采纳的出格留意。此外，需要留意的是，在固定之前，所有的组织必需在低温前提下快速处置，以避免快速腐朽和枯燥。
目的：目的的程度和亚细胞定位在IHC尝试设想中极为重要。例如，一个表达量较高的卵白能够不费吹灰之力就能检测到，用一个标识表记标帜有荧光体的一级抗体就足以检测。然而，检测含量较少的目的则需要信号放大的办法。目的在细胞内的定位间接影响到所需的通透水平。因而，固然核卵白需要更严厉的基于外表活性剂的透化处置，但细胞量成分能够用相对暖和的处置来检测。细胞内膜卵白的检测可仅通过冻融处置实现[8]。
表位：表位是抗原的小的三维外表区域，抗体味特异性地与之连系。重要的是，在IHC过程中，抗体所连系的表位在参加抗体的时候是表露的。在组织处置过程中，可能被抗体识此外表位有时会被掩盖，可能需要采纳一些步调，如抗原检索，以表露出表位。
固定办法：固定是指通过固定目的使组织形态和细胞构造连结在固定形态。它能够避免组织变性并实现持久贮存。凡是情况下，在收成后不久，将组织浸泡在恰当的固定剂中数小时，然后再进一步处置停止切片。为了尽量缩短组织收罗和固定之间的时间，并实现平均的固定，在动物模子（如啮齿类动物）中，经心肌灌注固定剂是首选的固定办法。
固定剂：固定剂的选择和固按时间取决于所存眷的组织和抗原，需要优化[9,10]。不充实的固定可能会招致组织形态受损，而长时间的固定章会招致抗原的掩盖。固定剂分为三类：醛类（甲醛和戊二醛）、醇类（甲醇和乙醇）和丙酮基固定剂。最常用的固定剂是在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中造备的4%（w/v）多聚甲醛溶液。
样品造备办法：样品造备包罗将固定的组织块嵌入基量中，使组织可以被切成厚度平均的切片。那一步调需要认真停止，以确保组织在选择的基量中准确摆列。两种常见的样品造备办法是福尔马林固定白腊包埋（FFPE）和冷冻。福尔马林固定法涉及到组织样本的脱水，然后逐步嵌入白腊中。冷冻包罗在将样本嵌入更佳切割温度（OCT）化合物之前利用蔗糖对其停止冷冻保留。一旦组织片被白腊包埋或冷冻，它们就能够在恰当的前提下保留较长时间。
切片办法：IHC是在组织的薄片长进行的。切片的厚度和平均性关于确保抗体的有效渗入和组织的准确成像十分重要。FFPE组织凡是在室温下用切片机停止切片，而冷冻组织则在零度以下的低温下停止切片。切片能够沿着组织的冠状面、矢状面或侧面获得。然后将切片安拆在带正电的载玻片上，确保切片在整个IHC过程中被固定住。
组织切片的预处置：一旦组织切片筹办好了，就能够对其停止处置，以利于抗体的渗入，促进免疫原性反响。固然FFPE切片需要利用有机溶剂（如二甲苯）停止脱白腊处置，然后再停止复水步调，但OCT复合包埋切片能够间接用于下流处置。因为冷冻切片的处置步调较少，那种办法对卵白量的检测愈加灵敏。然而，FFPE供给了优良的形态学保留，并有助于实现更薄的切片（薄至2微米）。
抗原检索办法：基于甲醛的固定往往会招致抗原表位的掩盖。因而，需要停止抗原检索，以去除表位，使其可用于抗体连系，而且经常停止抗原检索[11]。那一步调在对FFPE组织停止IHC时很重要，但对冷冻组织切片来说可能过于苛刻，能够省略。抗原检索能够通过加热（热诱导表位检索：HIER）或在恰当的缓冲液中通过酶降解（卵白酶诱导表位检索：PIER）来实现。
渗入：渗入是重要的第一步，使组织中的细胞量膜变得多孔，从而允许IHC试剂和抗体进入。凡是情况下，外表活性剂如Triton X-100、Tween-20、皂素和地黄素被用来实现通透性。然而，为了更暖和地透化以保留细胞内膜，可将切片停止冻融处置。固定剂，如甲醇和丙酮，也能使组织透化，当利用那些固定剂时，能够省略那一步调。外表活性剂的浓度和孵化时间是按照所利用的固定剂、组织切片的厚度和感兴趣的抗原的亚细胞定位等因素决定的。
阻断缓冲液：虽然抗体与抗原的连系能够十分特异，但因为各类分子内力的感化，一些抗体可能会粘附在某些非特异性的细胞成分上。在参加抗体前在阻断缓冲液中孵化有助于避免抗体在组织中的非特异性连系。常用的阻断剂是一般血清和牛血清白卵白。当利用发色剂检测时，还需要阻断内源性酶的活性，能够通过利用过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性或左旋咪唑阻断内源性碱性磷酸酶活性来实现。
检测办法：对目的抗原的检测能够是间接的，即标签间接附着在一级抗体上，或者是间接的，即标签或催化发色反响的酶附着在二级抗体上。此外，能够接纳信号放大的办法来进步信号检测的灵敏度。
一级抗体：间接与感兴趣的抗原表位连系的抗体被称为一级抗体。一级抗体的选择是IHC尝试设想的一个重要步调[12]，人们需要确保所选择的抗体对所研究的物种是特异性的。对目的抗原的抗体的特异性也需要停止彻底评估。一级抗体可能是多克隆或单克隆的：多克隆抗体由多个独立的抗体分子构成，能够识别统一目的的差别表位，而单克隆抗体都识别不异的单一表位。一级抗体的浓度需要通过认真的尝试来确定，以到达更佳效果。
二级抗体：二级抗体是识别一级抗体的抗体，从而可以检测到目的抗原。二级抗体凡是被标识表记标帜为一种酶，以促进信号的放大，用于发色检测，或者它们可能被标识表记标帜为一种荧光体。
信号放大：关于低程度表达的目的抗原，可能需要停止信号放大以进步该手艺的灵敏性。利用的几种信号放大战略包罗：阿维菌素-生物素复合物（ABC）办法、标识表记标帜的链霉菌素-生物素（LSAB）办法和泰拉米信号放大（TSA）[13]。
标签：用于检测目的抗体的标签附着在一抗或二抗上，能够是荧光性的（如免疫荧光），也能够是发色性的。荧光性标签，如荧光素和四甲基罗丹明（TAMRA），能够在荧鲜明微镜下间接察看。色素法是指在抗体毗连的酶，如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）的存鄙人，将发色底物，如3,3-二氨基联苯胺（DAB）和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸（BCIP）/硝基蓝四氮唑（NBT），转化为彩色产品。
反染：组织凡是用二级核或细胞量染色剂来标识表记标帜所有的细胞，并帮忙将IHC标识表记标帜的细胞与组织的一般形态对照起来，从而供给一种比照。与染色IHC标签一路利用的染色剂包罗苏木精、核快速红和曙红；而与荧光IHC标签一路利用的染色剂包罗4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）、Hoechst33342和碘化丙啶。
拆片：将筹办好的组织切片安拆在具有恰当折射率的介量中，以便于在显微镜下成像，庇护荧光标识表记标帜的切片不被光漂白，并避免切片枯燥。常用的拆片介量包罗DPX、合成树脂和含有抗褪色剂的甘油基拆片介量，用于荧光标识表记标帜的切片。
多重检测：当一个尝试需要同时查询拜访一个以上的目的抗原时，就会停止多重检测。荧光标识表记标帜是多重检测的首选办法，因为有在整个可见光谱和临近波长范畴内发光的标签。在停止多重检测时必需出格留意避免二级抗体的穿插反响。
成像办法：色素标签能够用光学显微镜检测。荧光或共聚焦显微镜可用于检测荧光团。电子显微镜可用于用胶体金颗粒停止免疫组化标识表记标帜后的成像[14]。
量控：要确定IHC尝试成果的实在性，恰当的对照是不成贫乏的。一个已知目的抗原表达的组织样本能够做为一个阳性对照。同样地，一个已知没有目的抗原的样本能够做为阴性对照。此外，还需要利用抗体对照来验证抗体的特异性[12]。
免疫组化研究计划示例将所有那些变量放在一路，一个通用的IHC协议将包罗以下步调[15]。（图4）。
固定：从生物体内收罗目的组织，在4℃下用4%（w/v）甲醛固定16-24小时。样品造备和切片：关于FFPE切片，利用酒精梯度对组织停止脱水，白腊包埋，获得2-4 mm厚的切片并安拆在带电的玻片上。关于冷冻切片，将组织包埋在OCT化合物中，获得4-8 mm厚的切片并安拆在带电的玻璃玻片上。脱脂：那个步调只对FFPE切片停止。玻璃片上的切片在二甲苯中去白腊化，然后用酒精梯度停止补水。抗原检索：一般来说，HIER是首选，能够通过将切片在柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）中的压力锅（压力下3分钟）或微波炉（20分钟）中孵化来停止。然后用PBS Tween-20清洗切片两次（2 × 5分钟）。过氧化物酶的阻断：为了阻断内源性HRP活性，切片在室温下用3%（v/v）的过氧化氢溶液孵育15分钟。然后用PBS Tween-20清洗三次（3 × 5分钟）。渗入：那一步是可选的；切片能够在PBS中的0.1%（v/v）Triton X-100中室温下孵化10分钟。在停止下一步之前，用PBS Tween-20清洗切片三次（3 × 5分钟）。阻断：将切片与3-5%（v/v）的一般血清在室温下孵育30分钟，在此过程中产生了二级抗体的统一物种。一级抗体：在室温下将切片与物种婚配的一抗在更佳浓度下孵育1-4小时，或在4℃的水化室中孵育留宿。一级抗体可在PBS或阻断缓冲液中稀释。然后停止两次PBS Tween-20清洗（2 × 5分钟）。二级抗体：然后将切片在PBS中稀释至恰当浓度（如1:1000）的生物素化二抗中孵育，在室温下孵育30分钟-1小时。用PBS Tween-20清洗切片三次（3 × 5分钟）。信号放大：然后将切片在PBS中的链霉亲和素-HRP中在室温下孵育30分钟。用PBS Tween-20冲刷切片三次（3 × 5分钟）。色素检测：然后将切片与含有1%（w/v）DAB（250 μL）和0.3%（v/v）过氧化氢（250 μL）的溶液在5 mLPBS中在室温下孵育1-3分钟，曲到呈现棕色。然后用蒸馏水洗三次（3 × 5分钟）。反染：可将切片在苏木精中孵育1分钟，停止反染色。拆片：然后用酒精梯度对切片停止脱水，并安拆在DPX中。成像：可利用光学显微镜对切片停止成像。图4 | IHC中涉及的关键步调，从样品造备到检测和成像。
免疫组化阐发的长处和缺点
表1总结了IHC的一些次要长处和缺点。
表1 | IHC的长处和缺点。
免疫组化有什么用处？免疫组化是一种简单且具有成本效益的手艺，已成为病理学家和科学家的一个重要东西。那里列出了那种手艺的一些应用：
肿瘤学中的生物标记物评估：IHC是一种十分流行的东西，用于检测癌症诊断中的生物标记物，以及开发新的生物标记物。IHC能够停止肿瘤检测、分期和分类，此外还能够预测肿瘤的预后和领会肿瘤对治疗形式的反响。基于IHC的生物标记物对乳腺癌[17]、前列腺癌[18]、胰腺癌[19]、肺癌[20]、膀胱癌[21]、结曲肠癌[22]和卵巢癌[23]的诊断和治疗已经变得至关重要。传染性疾病的诊断：IHC做为一种重要的东西，用于检测和判定传染者组织样本中的病原体抗原，那有助于传染性疾病的治疗[24]。细菌性病原体如巴顿氏菌、耶尔森氏菌、苍白球菌、沙眼衣原体；病毒性病原体如人类疱疹病毒8型（HHV8）、爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）；实菌性病原体如白色念珠菌和新型隐球菌var. gattii；以及原生动物病原体，如恶性疟原虫和克鲁斯氏锥虫，都已胜利地用IHC判定。评估神经退行性疾病：异常的卵白量构象和聚集能够用IHC判定和评估，是许多神经退行性疾病的常规特征，包罗阿尔茨海默病（AD）、慢性创伤性脑病（CTE）、停止性核上性麻木（PSP）、皮克氏病、路易体病、多系统萎缩（MSA）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）[25]。人类卵白量图谱：IHC通过绘造人类卵白量组图谱，对大数据时代做出了奉献[26]。人类卵白量图谱[27]是一个免费供给的贵重资本，它包罗了组织程度的表达信息，涵盖了90%的所有卵白量编码基因。诊断科学编纂团队搜集、整理和编撰，如需更多资讯，请存眷公家号诊断科学（DiagnosticsScience）。
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